楊輝, 馬修兵, 孫彥飛, 王鐵棟, 慶豐, 趙雪松. 小型熒光激光雷達測量六種典型生物戰劑模擬物二維熒 光光譜[J]. 光譜學與光譜分析, 2019,39(3): 802-806.

YANG Hui, MA Xiu-bing, SUN Yan-fei, WANG Tie-dong, QING Feng, ZHAO Xue-song. 2D Fluorescence Spectra Measurement of 6 Kinds of Bioagents Simulants by Short-Range   Lidar[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2019,39(3): 802-806.

Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2019)03-0802-05 Permissions

小型熒光激光雷達測量六種典型生物戰劑模擬物二維熒光光譜

楊輝 1  , 馬修兵 2, 孫彥飛 1, 王鐵棟 1, 慶豐 1, 趙雪松 3 摘要

關鍵詞: 生物戰劑; 模擬物; 近場熒光激光雷達; 導數熒光光譜 中圖分類號:TN247 文獻標志碼:A

2D Fluorescence Spectra Measurement of 6 Kinds of Bioagents Simulants by Short-Range Lidar

YANG Hui1, MA Xiu-bing2, SUN Yan-fei1, WANG Tie-dong1, QING Feng1, ZHAO Xue-song3

Abstract

Keyword : Bioagents; Simulants; Short range fluorescence lidar; Derivative fluorescence spectra

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引 言

生物戰劑在大氣中的散布能對軍民用設施和人員造成極大的危害,  目前缺乏切實有效的探測和識別 手段[1] 。 對生物戰劑的遙測和先期預警, 避免和減少人員、 設施和裝備傷亡, 尤為重要。 在光學生物

戰劑遙感領域, UV-LIF 在探測和識別方面發展迅速。 原則上, 蛋白質、 病毒、 細菌和其他生物有機 物, 至少含有一種以上的熒光團, 可以在特定紫外光的激勵下發射出熒光, 且這些生物物質發出的熒光，與其所含生物熒光團的特定分子結構、 外部環境或溶質的物化特性等密切相關, 因而在熒光譜特征方面 表現出極大的差異性[2,3]。

成團泛菌 Pantoea agglomerans(Pan)原名草生歐氏桿菌是植物體上常見的附生菌, 是土拉桿菌  的模擬物; 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus(Sta)是一種重要的條件致病菌, 廣泛分布于自然  界, 可以引起人和動物的軟組織感染, 并可導致生命威脅的肺炎、 菌血癥及包括心內膜炎、 膿毒性關節 炎、 骨髓炎等的嚴重并發癥, 還能引發食物中毒及中毒性休克綜合癥等,  占社區和醫院感染源的 60%和 80%; 大腸桿菌 Escherichia coli(EH)廣泛分布于自然界, 包括腐生菌、 寄生菌和人及動物的病原菌,   多數是人和動物腸道正常菌群的重要成員, 1949 年— 1969 年的 20 年間, 美國在狄特里克堡試驗  場、 道格威試驗場和化學中心等 34 個非公共場大約進行了 108 次曲霉菌和大腸桿菌模擬生物戰劑 測試; 球芽孢桿菌 Bacillus globigii(BG)是炭蛆桿菌的非致病性模擬物, 其孢子形態形狀與炭蛆桿菌極  為相近, 休眠態孢子可以抵御多數苛刻惡劣的外部環境, 在環境適宜時則迅速生長。 2000 年前后的數十 年, 加拿大國防部, 就一直持續地將球芽孢桿菌作為炭疽桿菌進行研究。 成團泛菌、 大腸桿菌為革蘭氏 陰性桿菌, 球芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌。

數十年來, 大多數學者都將工作聚焦在生物戰劑光學(如熒光, 磷光)遙測領域, 極少對生物戰劑模  擬物的選擇, 培養及熒光光譜等方面的研究進行報道[4,5,6,7,8] 。 本工作對成團泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌四種常見的細菌類生物戰劑模擬物[9]的培養和熒光光譜測定, 以及兩種毒素 類生物戰劑模擬物的熒光光譜測定情況進行了報道, 對光譜特征進行了分析, 并討論了光譜指紋特征的抽 取方法, 為生物戰劑熒光光譜特征數據庫的建立, 打下了基礎。

1 材料及熒光測量平臺

1.1 生物戰劑模擬物

選取了四種典型細菌類生物戰劑模擬物和兩種毒素類生物戰劑模擬物, 其中, 細菌類模擬物為成團 泛菌、 金黃色葡萄球菌金黃亞種Staphylococcus aureus subsp. Aureus(Sta)、 大腸桿菌(大腸埃 希氏菌)和球芽孢桿菌, 毒素類模擬物為牛血清 BSA 和卵清蛋白 OVA。 BSA 和OVA 均來自 Sigma

Aldrich, 成團泛菌、 金黃色葡萄球菌金黃亞種、 大腸桿菌(大腸埃希氏菌)和球(芽孢)桿菌均購自中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心, 編號分別為 CGMCC 1.4006, CGMCC 1.128, CGMCC  1.2812 和 CGMCC 1.1202。

1.2 菌種復壯與培養

用浸過 75%酒精的脫脂棉嚴格消毒冷凍管, 在超凈臺( 型號 SW-CJ-1D)無菌環境中旋  開裝有復溶液的滴瓶蓋, 取約 1 mL 復溶液, 加入到冷凍管中, 輕輕振蕩, 使凍干菌株溶解呈懸浮狀。 用 無菌吸管吸取菌懸液, 轉移到復溶液滴瓶中。 做好標識, 在 HNY-2102C 立式恒溫振蕩培養箱(天津歐   諾)中適宜溫度下培養。 成團泛菌和大腸桿菌的培養基為 LB 培養基, 金黃色葡萄球菌和球芽孢桿菌的培  養基為 TSB 培養基, 配制好后用高壓蒸汽滅菌 17 min。 TSB, LB 培養基的 pH 測定和調節由 pH 計

(Sartorius, 型號 PB-10)完成。 成團泛菌和球芽孢桿菌的培養溫度為 30 ℃, 金黃色葡萄球菌和大腸桿 菌的培養溫度為 37 ℃。

1.3 熒光測量平臺

熒光物質在紫外激光的激勵下, 會輻射出寬譜熒光, 不便于類型的識別。 為提高類型辨識能力, 激 光器輸出的 3 倍頻 355 nm、 4 倍頻 266 nm 波長激光, 分別用于氨基酸熒光分子、 NADH 和維生素 B 熒光的熒光和偏振測量, 355 和 266 nm 兩個波長的激光能量脈寬均為 5 ns, 脈沖能量約為 5 mJ, 重復頻率為 10 Hz。 熒光信號由 400 mm 口徑的牛頓型望遠鏡收集, 并由光譜儀進行分析, 其分辯率為  2/4 nm。 熒光的探測范圍為 250650 nm, 探測距離不小于 20 m。 圖 1 為近場激光雷達的熒光測量 原理圖。

2 四種菌的生長曲線測定

2.1 樣品準備和測定方法

在振蕩培養箱里, 對成團泛菌、金黃色葡萄球菌、球芽孢桿菌和大腸桿菌等四種典型細菌類生物戰劑模擬物進行了 28 h 的平行培養。然后, 在超凈臺中按無菌操作進行菌液準備, 即取已經劃過線的固體培養基, 用無菌牙簽沾取少量的菌體置于含有約50 mL 的液體TSB 或LB 培養液中, 放置于30 ℃/37 ℃恒溫振蕩培養箱內, 每隔2H分別吸取成團泛菌、金黃色葡萄球菌、球芽孢桿菌和大腸桿菌營養肉湯培養液1 mL, 并用10 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成菌懸液, 用UV1102 紫外可見分光光度計測定四種菌液在600 nm 波長上的吸光度, 用0.9%無菌氯化鈉溶液作為空白參比, 記錄四種菌液的吸光度值OD。OD 測量均重復三次, 直至菌液OD 值達到平穩狀態。

2.2 吸光度測量結果及討論

從細菌復活后的芽孢態開始, 分別對各菌不同生長時期的吸光度值進行了三次重復測定, 得到了各菌的生長線。由圖2 可知：

(1)在設定的培養條件下, 四種菌的生長階段較為明顯, 主要有萌發期、對數生長期、平穩期和衰亡期。 其中, 球芽孢桿菌和成團泛菌兩種菌的萌發期較短, 可能是菌種培養環境與現有培養環境相近, 在培養初期溶氧和酸堿度都較為適宜, 菌種極快地適應了新環境并對數生長; 球芽孢桿菌和成團泛菌的對數生長期持續約4 h, 從第4 小時后到第24 小時結束為過渡平穩期, 之后進入穩定平穩期。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的萌發期相對較長, 約為15 小時和6 小時; 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的對數生長期分別為2 和6 h。成團泛菌、金黃色葡萄球菌、球芽孢桿菌和大腸桿菌的代時分別為0.99, 0.835, 1.07  和 1.909 h。

(2)只有大腸桿菌有明顯的衰亡期, 在約5 h 的平衡期后, 大腸桿菌進行營養和空間的競爭, 有些大腸桿菌死亡, 吸收率隨即開始衰減, 其整個生命周期呈“ J” 型; 說明細菌的培養生長曲線受遺傳性、 接種量和培養條件等因素的影響, 會有所變化。

3 熒光光譜測量

3.1 液態氣溶膠準備

BSA 和OVA 氣溶膠配制: 在超凈臺用去離子水 ddH2O 稀釋, 得到的溶液濃度約為 1.0× 106和5.0× 106 個 · mL-1, 搖勻后4 ℃靜置 10 min, 熒光待測。

成團泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌營養態細菌氣溶膠配制: 在超凈臺分別汲取過夜培養(約 24 h)后的 Pan, Sta 和 BG 菌液 5 mL, 注入 15 mL 生理鹽水的離心管中, 在 7 500 r · min-1轉速下離 心 10 min 兩次, 去掉上清液, 再分別加入 10 mL 生理鹽水, 搖勻后 4 ℃靜置 10 min, 熒光待測。

大腸桿菌營養態細菌氣溶膠配制: 在超凈臺分別汲取 15 h 培養后的菌液 5 mL, 注入 15 mL 生理 鹽水的離心管中, 在 7 500 r · min-1轉速下離心 10 min 兩次, 去掉上清液, 再分別加入 10 mL 生理鹽 水, 搖勻后 4 ℃靜置 10 min, 熒光待測。

3.2 熒光測量方法

熒光測量在距離激光雷達約 20 m 的噴霧型測量腔中進行。 氣溶膠室長 15 m, 尺度為 2.0 m × 2.0 m。 兩端配有活動門, 掛起時可以關閉, 放下時打開。 測量方法: (1)室門關閉, 將選定的 BSA、OVA、 成團泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌營養態氣溶膠, 在數秒時間內利用氣流式 霧化器和風扇, 充分混合均勻, 并保留 10 s 以確保室內具有良好的各向同質性; (2)然后打開腔前門, 用 激光雷達完成熒光測量; (3)激光雷達數據采集結束后, 打開后門, 在數分鐘內清空測量腔中的氣溶膠;(4)測量腔中氣溶膠清空并紫外線滅菌后分別測量同等濃度超純水和生理鹽水的熒光背景信號, 作為參比 扣除。

3.3 雷達回波的小波去噪和平滑

在激光回波檢測中使用的去噪方法有匹配濾波、平滑濾波等; 當信號波形已知時, 匹配濾波方法能 夠有效地實現信號檢測, 是輸出信噪比較大化意義上的線性濾波器, 但對于非平穩的回波信號其性能會大 幅下降。 尤其是, 滑動平均濾波只相當于低通濾波器, 中值濾波降噪優勢是消除孤立的噪聲, 當信噪比很 低時, 改善信噪比性能有限[9,10]。

熒光信號較 MIE 散射信號低數個數量級, 為盡可能地保留信號光譜的特征, 不能采用常規的平滑降 噪處理, 對激光雷達的原始 PRR 信號, 采用了分解級數為 4 的 Daubechies(db4)小波基, 與滑動平均方 法比較而言, 利用該小波去噪可以更好地保留了激光雷達回波信號的峰值特征。

3.4 2D 熒光發射譜和二階導數熒光發射譜

根據生長曲線, 大腸桿菌取 15 h 菌液, 其他三種則是 24 h 菌液, 在熒光測量腔中進行熒光和背景 測量。 去除信號中的拉曼和瑞利散射信號后, 經歸一化, 得到了如圖 3 所示的各模擬物液態氣溶膠的二  維熒光發射譜。 經與色氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸的本征二維熒光譜對比分析后, 可得到以下結論:

(1)BSA, OVA 以及成團泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌營養態細菌氣溶膠的二 維熒光譜分布、 譜形與色氨酸一致性較高, 熒光譜的半高寬 FWHM 為 60 nm, 說明其主要成份為色氨 酸, 酪氨酸和苯丙氨酸的熒光貢獻基本為0;

(2)相對于色氨酸的 280/350 nm 本征熒光峰, 其他所有模擬物的熒光發射中心波長均存在不程度 的紫移, 其中 OVA 和 BSA 的熒光發射波長分別紫移了 18 和 12 nm, 熒光峰位于 280/332 和280/338 nm; 金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌、 球芽孢桿菌的熒光發射波長紫移了 10, 16, 8 和 16 nm, 熒光峰位于 280/340, 280/336, 280/342 和 280/334 nm;

(3)僅利用單個或數個激發波長得到的發射譜, 要區分和識別不同生物物質, 較為不易。 而將光譜 進行高階處理, 如求解二階導數, 得到二階導數譜, 以將光譜曲線的差異放大。 對熒光光譜求二階導數 后, 光譜譜帶變窄, 二階導數光譜的極小值對應熒光光譜峰值, 在定量測量上表現出很高的靈敏性[11] 。 圖 3(b)示出了三種液態生物氣溶膠和標準熒光組分色氨酸的二階導數譜, 可見二階導數的最小值, 與圖 3(a)中的熒光峰值位置一致。 此外, 二階求導后的譜曲線變得非常雜散, 不平滑, 這主要是由于被測物 濃度低, 受背景影響較大所致。